微生物菌种保藏方法及注意点

　　传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于zui适生长温度为好。若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。

　　一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。

　　传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉；②菌株的遗传性状容易发生变异；③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期转种，工作量大；⑤杂菌的污染机会较多。

　　2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物（如产孢能力低的丝状菌）的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。

　　3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下几种，如

　　①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。

　　使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤（5克）置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基（以含水量为土壤zui大持水量的60%为宜），然后高压灭菌。再将需保存的微生物进行大量接种，培养至菌丝能用肉眼确认的程度为止，移入干燥器中经短时间干燥或风干后密封，冷藏或室温保存。

　　②砂土保存法：取清洁的砂，过60目筛去掉大砂粒，并用磁铁吸去砂中铁屑，再用NaOH溶液、10%HCl溶液和水交替清洗数次，干燥后，置于试管或安瓶管中保持2～3cm深，再经干热灭菌后，加入1ml菌种培养液，经充分混匀后，放入真空干燥器中，*干燥后熔封保存。也可用二份洗净的砂（经HCl预处理）和一份贫瘠、过筛的黄土搀和后灭菌，再进行菌种保藏。

　　③硅胶保存法：以6～16目的无色硅胶代替砂子，干热灭菌后，加入菌液。加菌液时，由于硅胶的吸附热常使温度升高，因而需设法加以冷却。

　　④磁珠保存法：将菌液浸入素烧磁珠（或多孔玻璃珠）后再进行干燥保存的一种方法。在螺旋口试管中装入1/2管高的硅胶（或无水CaSO4），上铺玻璃棉，再放上10～20粒磁珠，经干热灭菌后，接入菌悬液，zui后冷藏、室温保藏或减压干燥后密封保藏。本法对酵母菌很有效，特别适用于根瘤菌，可保存长达两年半时间。

　　⑤麸皮保存法：在麸皮内加入60%的水，经灭菌后接种培养，zui后干燥保藏。

　　⑥纸片（滤纸）保存法：将灭菌纸片浸入培养液或菌悬液中，常压或减压干燥后，置于装有干燥剂的容器内进行保存。

　　4、悬液保存法：即使微生物混悬于适当溶液中进行保存的方法。常用的有，

　　①蒸馏水保存法：适用于霉菌、酵母菌及绝大部分放线菌，将其菌体悬浮于蒸馏水中即可在室温下保存数年。本法应注意避免水分的蒸发。

　　②糖液保存法：适用于酵母菌，如将其菌体悬浮于10%的蔗糖溶液中，然后于冷暗处保存，可长达10年。除此之外，也可使用缓冲液或食盐水等进行保存。

　　5、寄主保存法：即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。

　　6、冷冻保存法：适用于抗冻力强的微生物。这些微生物可在其菌体细胞外遭受冻结的情况下而不受损伤，而对其它大多数微生物而言，无论在细胞外冻结还是在细胞内冻结，都会对菌体造成损伤，因此当采用这种保藏方法时，应注意以下几点，

　　①要选择适于冷冻干燥的菌龄细胞；

　　②要选择适宜的培养基，因为某些微生物对冷冻的抵抗力，常随培养基成分的变化而显示出巨大差异；

　　③要选择合适的菌液浓度，通常菌液浓度越高，生存率越高，保存期也越长；

　　④在菌液内不添加电解质（如食盐等）；

　　⑤可在菌液内添加甘油等保护剂，以防止在冷冻过程中出现菌体大量死亡的现象。同样，也可添加各种糖类、去纤维血液和脱脂牛乳等具有良好保护效果的溶剂，但对有些微生物而言，不加保护剂时更有效。

　　⑥原则上应尽快进行冷冻处理，但当加入保护剂时，可静置一段时间后再进行处理。

　　⑦就动物细胞而言，应在－20℃范围内以1℃/min左右的速度缓慢降温，此后必须尽快降到贮藏温度；而对绝大多数微生物而言，则不必如此，如结构较为复杂的原虫则可在－35℃范围内进行缓慢降温，而噬菌体则必需采用上述的二阶段法进行冷冻；

　　⑧若进行长期保存，则贮藏温度越低越好；

　　⑨取用冷冻保存的菌种时，应采取速融措施，即在35～40℃温水中轻轻振荡使之迅速融解。而就厌氧菌来说，则应选择静置融化的措施。当冷冻菌融化后，应尽量避免再次冷冻，否则菌体的存活率将显著下降。

　　常用的冷冻保存法包括：

　　①低温冰箱保存法（－20℃、－50℃或－85℃）：低温冷冻保存时使用螺旋口试管较为方便，也可在棉塞试管外包裹塑料薄膜。保存时菌液加量不宜过多，有些可添加保护剂。此外，也可用φ5mm的玻璃珠来吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器内，再放入低温冰箱内进行保存的。

　　②干冰保存法（－70℃左右）：即将菌种管插入干冰内，再置于冰箱内进行冷冻保存。

　　③液氮保存法（－196℃）：是适用范围zui广的微生物保存法。其操作步骤如下，

　　a、装安瓶管：使用尽量浓厚的菌体悬浮于含有适当防冻剂（保存霉菌不用防冻剂）的灭菌溶液中，将0.2～1ml的这种溶液分装于安瓶中，或在装有分散剂的安瓶中直接接种，或将菌丝体琼脂块直接悬浮于分散剂中。

　　b、熔封安瓶管：若直接贮存于气相液氮中（－150℃～－170℃）时，则不需熔封。

　　c、检查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下，将熔封安瓶管在适当的色素溶液中浸泡2～30分钟后，观察有无色素进入安瓶。

　　d、缓慢冷却：将熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮气以约1℃/min的速度冷却至－25℃左右，也可在－20℃～－25℃的冰箱内缓慢冷却30～60min。

　　e、速冷：zui后浸入液氮中快速冷却至－196℃。

　　7、冷冻干燥保存法：其原理是首先将微生物冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分。事实上，从菌体中除去大部分水分后，细胞的生理活动就会停止，因此可以达到长期维持生命状态的目的。该方法适用于绝大多数微生物菌种（包括噬菌体和立克次氏体等）的保存。

　　在进行冷冻干燥时，需注意以下几个问题：

　　a、冷冻干燥前的培养条件：首先检验菌种纯度。一般地说，将待保存的微生物在营养丰富且容易增菌的培养基上进行培养为宜；菌龄以达到对数生长期为好；若为有芽孢或孢子的微生物，则以芽孢和孢子形成以后进行保存为好；菌液浓度以高为好，如细菌应达到109～1010/ml。

　　b、菌株号码等的标记：可在安瓶外侧标记或在安瓶内封入标签。

　　c、安瓶的准备：将安瓶在2%HCl中浸泡过夜，自来水冲洗3次后，蒸馏水刷净，干燥，塞棉塞，贴标签，干热灭菌或温热灭菌后，60℃恒温干燥。

　　d、添加保护剂：常用的保护剂有脱脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉汤以及加7.5%葡萄糖的血清等等。

　　8、Bordelli氏法：取干净的小试管（8×60mm）塞上棉塞，灭菌。用灭菌的脱脂牛乳洗脱试管斜面上的菌苔，制成浓厚菌悬液。然后用无菌吸管将菌悬液滴入小试管底部。每管一滴，然后转动小试管使菌液分散在试管底部的壁上。标记菌名。将小试管装在15×150mm的试管中，在大试管底部事先装上1.5cm高的（P2O5或KOH），管口用带玻璃管的橡皮塞塞紧，蜡封。将大试管与真空泵连通，抽真空至0.1～0.2mm汞柱时，将玻璃管熔封，置室温暗处或冰箱保存。

　　仪器与材料

　　1、斜面菌种：丝状真菌、酵母菌、芽孢杆菌和无芽孢杆菌各一支。

　　2、接种用具一套。

　　3、灭菌物品：1ml、5ml吸管，长滴管，安瓶管，9ml无菌水试管，砂土管，液体石蜡，脱脂牛乳。其中，液体石蜡的处理为1.5kg/cm2压力灭菌1小时或1kg/cm2压力灭菌3次，每次30分钟。接着检查是否*无菌，即接入肉汤中检查有无杂菌生长。zui后放在60～80℃轰烤以去除水分。脱脂牛乳的处理为2000rpm离心10分钟脱脂，然后0.5kg/cm2压力灭菌20分钟，或间歇灭菌3次，经检查无菌后备用。

　　4、P2O5，无水CaCl2各一瓶。

　　5、真空干燥器，真空泵。

　　方法

　　1、液体石蜡覆盖法：取待保存的菌种斜面，用5ml无菌吸管向内加入灭菌石蜡，要求液体石蜡高出菌斜面1cm左右，若不够此高度，则常会引起斜面抽干现象。

　　2、砂土管法：用1ml无菌吸管吸取0.2～0.5ml菌悬液，滴入砂土管中，充分混匀后，将砂土管放入真空干燥器内，抽干，真空干燥器内需放置无水CaCl2。zui后，将干燥好的砂土管取出，迅速于火焰上蜡封管口，并在室温下或冰箱中进行保存。

　　3、冷冻干燥保藏法：

　　①用灭菌长滴管取出2滴（约0.1ml）无菌脱脂牛乳，置于无菌安瓶管中，然后用另一支无菌滴管取出等体积的浓菌液，同样置于此安瓶管中，充分混匀。

　　②集中安瓶管，置于100ml烧杯中，将烧杯装进真空冷冻干燥器的钟罩内，开机并开冷却水后，使菌液在－20℃温度下迅速冻结成固体，然后抽真空使水分升华，2小时后，可以停止冷冻并在稍高的温度下进行干燥，直至全干为止。

　　③zui后取出安瓶管，并将其与真空泵连接，再抽真空后，迅速将安瓶管熔封，zui后冰箱保存。

　　4、甘油管保藏法：在5ml菌种保藏管中，将等体积的菌悬液和40%的甘油充分混匀后，于－20℃冰箱中保存。